十步優化HPLC

高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)是7O年代以后發展最快的分析手段，從最初 的少數科研部門掌握到現在的普通生產、實驗室等大規模應用，HPLC 作為質量控制，分析化驗和有效分離的技術在科研和生產中發揮了越來越重要的作用。 HPLC的原理與普通液相色譜是相同的，都是根據待分析的混合樣品中各個組分在流動相和固定相（即色譜柱）中的分配系數不同來達到分離的目的。
雖然作為一種簡單的技術，HPLC仍然存在著可能出錯的地方，比如說壓力混亂、管道阻塞、和層析柱不能永遠使用等問題。以下來自著名科學儀器設備制造公司Waters Corp和LC Resources的專家提出的幾點HPLC優化建議。　
1． 了解你要用的緩沖液
“人們總是為了對相同的處方做出了不同的解釋而給我支付昂貴的咨詢費。”
——LC Resources總裁Tom Jupille
HPLC依賴于分析物之間的微分均衡，固定相(填料),和流動相（溶劑）。常規的流動相一般由50％的乙腈加上50％，10 mM，pH2.5的磷酸鉀緩沖液組成，至少有四種混合它們的方法：正確法、容易法、錯誤法和笨方法。
正確的方法應該是：按照正確的比例混合10 mM的磷酸和10 mM的磷酸二氫鉀達到pH 2.5。然后混與等體積的乙腈混合。這個過程需要生成標準的操作流程，明確標定緩沖液的配方和有效期等。
2．每天更換緩沖液　
水 流動相有可能被細菌，模具和樣品殘留污染，這些污染的出現可能會升高系統的壓力和提高檢測儀的檢測背景，當然當裝流動相的瓶子底部出現混濁的時候可以很明 顯的發現這些污染，但是當這些污染以薄膜的形式存在于瓶底或者瓶壁則不容易發現。因此要不每天更換操作的緩沖液，要不確保層析方法中包含10％－15％的 有機溶劑，減少污染。
3 .防止不合格樣品進入層析柱
“盡最大可能使不合格的樣品遠離層析柱”
——Fred Hutchinson Cancer Research Center的蛋白質組主管 Jupille. Philip Gafken
要 分離的樣品一定不能對層析柱產生傷害，研究人員在進行分離之前需要考慮像：鹽是否會沉淀？去垢劑是否會包被或者損害填料等等這樣的問題，而且專家也建議將 單純的蛋白沉淀步驟（從血漿中分離分析物的通用方法）轉換為固相或者液相提取。比如說，如果你想尋求有機藥物代謝物，你可以將樣品與有機溶劑混勻使所想要 的化合物進入溶劑中，而將大量的雜質留在水相中。
4.使用保護柱 
保護柱或者預柱是指置于主分析柱前的一根短 （0.5-2 cm），相對便宜的柱子?；ù蟾?0到400元購置這樣一根保護柱可以明顯地延長昂貴的分析柱的壽命。有研究人員在正常的環境下進行了對比 實驗，結果發現一根柱子可以進行1， 000-2，000次填注，而安置了保護柱之后，柱子可以進行10，000次的填注之后仍未出現輕微的改變。而且保 護柱的填料也應該周期性的改變，大約每 200-500次填注后更換一次——假如樣品較臟則應該更頻繁更換。
5，不要讓填料保存在水緩沖液中 
在 包含流動相的緩沖液還殘留在系統中的時候切勿關閉HPLC系統。這是由于溶劑可以蒸發，留下緩沖液結晶，最終導致內部損傷填料，由此引起一些小毛病。專家 們認為用不含溶劑的緩沖液沖洗HPLC系統或者從不關閉HPLC系統，這樣在其它條件一致的情況下可以延長柱子壽命，另外把柱子放進運載溶劑 （shipping solvent）中保存(例如純乙腈)也可以延長層析柱壽命——因為運載溶劑對柱料的損傷最小。
6.確定“周圍環境”是指什么 
許 多HPLC方法要求適合的環境溫度（ambient temperature），但總會遇到這樣的問題：這里的室溫指的是二月的蒙特利爾還是七月的波多黎 各呢？也就是說，實際上HPLC的工作溫度可以是隨心所欲的-4°C到25°C之間的任意溫度。到底什么是合適的周遭環境，我們必須根據具體的情況來確 定，這是因為色譜法依賴于分析物在固定相和流動相之間的平衡進行分離，而平衡當然依賴于溫度，所以當你改變溫度，平衡分布也會改變，保留時間改變，可能出 現誤識別樣品峰。
7．每天檢查系統的壓力　
雖然準確值依賴于你所使用的方法，但前提是系統的壓力不能明顯的高于或者低于前一天的 壓力，或者說不能不穩定，比如2，000±10psi可能很不錯，而 1,500±700 psi則不適合。研究人員需要經常記錄壓力，當然許多現代的 HPLC系統具有記錄泵壓力數據的特性，這些數據在維修中起到不可估量的作用。比如說假如說有一天你突然在一系列的運轉中得到許多陰性結果。有可能是所想 要的樣品峰偏離了它所對應的保留時間區（retention time），這個時候你要做的首要事情就是檢查泵壓力的記錄
8.不要在檢查接頭方面省事
不要忽略泄漏。隨著時間的積累這對于實驗的影響更大，不僅僅是不方便的問題，滲漏使得保留時間的偏移，導致所想要的樣品峰延遲出現。專家的建議是：至少會將能見到的接頭都掃視一遍。假如你發現了滲漏現象，切斷接頭并替換。
9．一次只能更換一樣東西　
當東西出現問題的時候，切忌一次性換完所有東西。在維修中，應該從系統整體出發，因此不能一次更換預柱，溶劑，和檢測燈，而應該每次只更換一樣東西。
10．每天檢測　
在你不知道HPLC的日常運轉情況下，你不可能對它進行維修，所以專家建議每天對HPLC進行檢測，收集相關的數據。